疏水层析替代反相层析在核酸药物纯化工艺中的应用

核酸药物是继抗体药之后备受市场期待的下一代生物药物。目前已有12种核酸药物获批上市，预计今后每年将会有3～4种核酸药物获批。作为主流核酸药物的合成寡核苷酸，在经过固相法或液相法的化学合成工艺后，通过反相层析（RPC）或离子交换层析（IEC）等方法进行分离和纯化。

但是，普通RPC工艺无法完全去除目标产物中的相关杂质，而且由于大量使用有机溶剂，需要进行废液处理、配备防爆设备等，会产生对成本控制不利等因素。因此，相关人员正在研究使用可代替RPC的层析工艺——疏水层析。

01 与RPC相比，疏水层析的优势？

● 可以去除固相合成时从固相导出的样品溶液中含有的氢氧化铵等低分子。

● 合成过程中，保护基二甲氧三苯甲基 (DMT) 与目标物质结合的DMT-on目标物，与保护基脱落生成的DMT-off杂质更容易被分离。

● 可以分离目标产物的相关杂质，即N-1杂质、N+1杂质、P=0杂质、氰乙基化 (CNEt) 杂质、无碱基杂质等。

● 使用酸性洗脱液，可在柱内完成目标产物的脱三苯甲基化 (DMT基团的脱保护) 。

● 聚合物基质的填料可使用碱性溶液 (pH13以下)，还可用NaOH溶液对层析柱进行CIP清洗。

● 由于洗脱液几乎不使用有机溶剂，所以无需配备防爆设备，还可减少废液处理的费用。

02 合成寡核苷酸的纯化精制工艺示例

03 疏水层析填料分离合成寡核苷酸的实例

以下实例中使用了东曹公司的4种疏水填料对粗纯的寡核苷酸进行分离。

从上述各种类型的HIC填料分离粗纯的寡核苷酸的结果来看，DMT-off杂质在所有的HIC填料上均无法被吸附，而是直接流穿。另外，从目标产物的洗脱位置、与杂质的分离度 来看，TOYOPEARL Phenyl-650M和Butyl-650M这两款填料更适用于寡核苷酸的纯化。

04 使用疏水填料分离合成寡核苷酸时，柱内DMT基的脱保护处理

使用TOYOPEARL Phenyl-650M进行分离时，色谱柱进样、吸附粗纯的寡核苷酸 (DMT-on目标物) 样品后，先通过淋洗去除样品中DMT-off杂质。然后，在洗脱液中加入50 mmol/L醋酸、1 mol/L硫酸铵溶液，在柱内对目标产物进行DMT基的脱保护 (脱三苯甲基反应) 处理，从而获得脱三苯甲基DMT-off的ZZ目标产物。

另外，脱保护的DMT基团会吸附在色谱柱上，在CIP阶段 (用蒸馏水和30%的异丙醇清洗) 被洗脱去除。经此纯化，目标产物的回收率为99%，RPC-HPLC检测纯度达99%以上。由此证明，寡核苷酸可以使用HIC填料进行有效精制。

参考文献：

1)  Hybridon Inc., Patent WO 96/01268(1996)

2)  K. Ruanjaikaen et al., presentation by BioProcess International West(2017),San Francisco, USA

3)  Biogen MA Inc., Patent WO 2017/218454 A1(2017)